Modèle sphéroïde de mélanome 3D pour le développement de biomarqueurs de positronium

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 7648 (2023) Citer cet article

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Il a été récemment démontré que l'imagerie au positronium nouvellement inventée peut être utilisée pour améliorer le diagnostic du cancer en fournissant des informations supplémentaires sur la pathologie tissulaire par rapport à la valeur d'absorption standardisée actuellement disponible en tomographie par émission de positrons (TEP). L'imagerie au positronium utilise les propriétés des atomes de positronium, qui sont construits à partir des électrons et des positrons produits dans le corps lors des examens TEP. Nous avons émis l'hypothèse que l'imagerie au positronium serait sensible à la discrimination in vitro de structures tridimensionnelles ressemblant à des tumeurs (sphéroïdes) construites à partir de lignées cellulaires de mélanome avec différentes activités cancéreuses et propriétés biologiques. La durée de vie de l'ortho-positronium (o-Ps) a été évaluée dans des sphéroïdes de mélanome de deux lignées cellulaires (WM266-4 et WM115) différant par le stade de la malignité. De plus, nous avons pris en compte des paramètres tels que le nombre de cellules, la taille du sphéroïde et la malignité du mélanome pour évaluer leur relation avec la durée de vie de l'o-Ps. Nous démontrons des résultats pilotes pour la mesure de la durée de vie de o-Ps dans des sphéroïdes sans matrice extracellulaire. Avec la signification statistique de deux écarts-types, nous avons démontré que plus le degré de malignité et le taux de prolifération des cellules néoplasiques sont élevés, plus la durée de vie de l'ortho-positronium est courte. En particulier, nous avons observé les indications suivantes encourageant des recherches supplémentaires : (i) les sphéroïdes WM266-4 caractérisés par un taux de prolifération et une malignité plus élevés ont montré une durée de vie o-Ps plus courte que les sphéroïdes WM115 caractérisés par un taux de croissance plus faible. (ii) Les deux lignées cellulaires ont montré une diminution de la durée de vie des o-Ps après la génération de sphéroïdes au jour 8 par rapport au jour 4 de la culture, et la durée de vie moyenne des o-Ps était plus longue pour les sphéroïdes formés à partir de cellules WM115 que pour ceux formés à partir de WM266 -4 cellules, quel que soit l'âge sphéroïde. Les résultats de cette étude ont révélé que le positronium est un biomarqueur prometteur qui peut être appliqué dans les diagnostics TEP pour l'évaluation du degré de malignité du cancer.

Au cours des dernières décennies, les cultures cellulaires tridimensionnelles (3D) ont été largement utilisées comme modèles in vitro, qui peuvent combler le fossé entre les conditions cellulaires in vitro et in vivo1. La comparaison de la culture cellulaire 3D à une monocouche cellulaire a révélé certaines caractéristiques physiologiques et morphologiques spécifiques, telles que les interactions cellule à cellule et cellule-matrice, la signalisation cellulaire, la prolifération et la nécrose. Contrairement à une culture cellulaire monocouche, un sphéroïde 3D est un modèle approprié pour imiter l'environnement réel des cellules tumorales et le taux de diffusion des nutriments entre les cellules. Les sphéroïdes tumoraux multicellulaires nous permettent d'étudier le mécanisme biochimique de la croissance cellulaire, les réactions enzymatiques et diverses modalités de traitement2,3,4,5.

Le mélanome est un type répandu de cancer de la peau qui a été classé comme l'un des cancers les plus mortels. Le mélanome, en tant que cancer le plus mortel, est une maladie multifactorielle dans laquelle la susceptibilité génétique et l'exposition environnementale, principalement à la lumière ultraviolette, jouent un rôle important6. Les facteurs de risque environnementaux désignés pour le cancer du mélanome sont l'exposition aux rayons ultraviolets solaires (UVB) et les coups de soleil (UVA). L'irradiation UVB cause des dommages directs à l'ADN, ce qui entraîne des ruptures de brins d'ADN. Les UVB favorisent également la survie des cellules de mélanome, l'angiogenèse et l'invasion en raison de l'augmentation de la pénétration des macrophages et des neutrophiles dans les cellules de la peau. Les UVA causent des dommages à l'ADN par la production de radicaux libres, qui induisent un stress oxydatif dans les mélanocytes. Le risque de mélanome peut également être associé à des mutations héréditaires et à des mutations somatiques, mais la tendance génétique n'est responsable que d'un petit nombre de cas. L'efficacité du traitement du mélanome aux stades avancés étant faible, il existe un besoin constant de développement de nouvelles thérapies ciblées, d'immunothérapie et de thérapies combinées7 (Fig. 1).

Vue schématique des mélanocytes et de la formation d'une lésion de mélanome dans la couche épidermique. (A) Les mélanocytes normaux ont une forme dendritique régulière et forment de nombreux processus de ramification s'étendant entre de nombreux kératinocytes (à gauche). Un mélanocyte atteint entre 36 et 40 kératinocytes, formant une unité de mélanine épidermique (EMU), avec une proportion équilibrée d'un mélanocyte pour chacun des 8 à 10 kératinocytes dans la couche basale de l'épiderme. Dans une lésion de mélanome (à droite), les mélanocytes perdent leur dendricité et deviennent malins et de forme amiboïde, modifiant leurs contacts cellule-cellule en exprimant différentes molécules d'adhésion (N-cadhérine au lieu de E-cadhérine exprimée par les mélanocytes)7. Les mélanosomes stockent les granules de mélanine produites par les mélanocytes, qui peuvent être distribuées parmi les kératinocytes environnants pour les protéger des dommages causés par les rayons UV. (B) Illustrations picturales des annihilations de positons dans la molécule de mélanine. Les atomes de carbone, d'oxygène, d'hydrogène, d'azote, de p-Ps et de o-Ps sont indiqués par des couleurs expliquées dans la légende. Les flèches en pointillés indiquent les photons provenant de l'annihilation directe électron-positon. Les flèches rouges indiquent les photons provenant de l'auto-annihilation des atomes o-Ps. Les flèches bleues montrent les photons de l'auto-annihilation de p-Ps. Les flèches vertes et brunes indiquent la désintégration de l'o-Ps via les processus de détection et de conversion, respectivement.

Bien que de nombreuses études aient été consacrées au diagnostic du mélanome dans les premiers stades, davantage d'investigations et de suivi sont nécessaires. Le taux de métastases chez les patients dues au mélanome est élevé, avec 350 000 nouveaux cas par an, et le nombre de nouveaux cas augmente significativement chaque année8,9,10.

Dans cette étude, un modèle sphéroïde 3D de deux lignées cellulaires de mélanome, WM266-4 et WM115, avec différents stades de malignité a été évalué. Les lignées cellulaires de mélanome WM266-4 et WM115 ont diverses propriétés biologiques qui les rendent différentes en termes de prolifération, de taux de migration et de taille cellulaire. L'activation des produits terminaux de glycation avancée (AGE), qui sont produits lors de la combinaison de lipides et de protéines avec le sucre dans le métabolisme humain, et de protéines telles que le récepteur des AGE (RAGE) et les kinases c-Jun N-terminales (JNK) dans la lignée WM266-4 rend cette lignée cellulaire plus invasive que la lignée WM11511. Par ailleurs, l'expression du gène SLC7A5 (variant du Large Amino-acid Transporter 1) dans WM115 est plus élevée que dans WM266-4, contrairement à l'expression du gène SLC7A8 qui est plus faible dans WM115 que dans WM266-412. Ces gènes sont impliqués dans l'import d'acides aminés et sont essentiels à la pigmentation cellulaire, et la lignée cellulaire WM115 est plus foncée que la lignée cellulaire WM266-4.

Dans cette étude, nous avons émis l'hypothèse que la différence entre le grade de malignité des mélanomes WM115 et WM266-4 présents au niveau de la physiologie cellulaire peut être sondée par des biomarqueurs de positronium. Un positronium est un atome exotique constitué de positrons et d'électrons13. Le positronium se forme également dans les espaces intramoléculaires lors du diagnostic TEP13. Dans le tissu, le positronium peut être formé et piégé dans les vides libres des espaces intramoléculaires, comme le montre la figure 114. Le positron émis par le radionucléide (par exemple, 18F dans le diagnostic TEP ou 22Na dans la durée de vie typique de l'annihilation des positrons expériences de spectroscopie (PALS)) pénètre dans l'objet, et après avoir perdu l'énergie, s'annihile avec un électron des molécules constituant les cellules. L'annihilation électron-positon en photons peut se produire directement (e + e− → photons (flèches en pointillés noirs sur la figure 1B)) ou via un atome de positronium [e + e− → positronium → photons (flèches pleines sur la figure 1B)]. Dans un quart des cas, le positronium est formé comme un état de courte durée (125 ps) appelé para-positronium (p-Ps), et dans les trois quarts des cas, il est formé comme un état de longue durée (142 ns ) ortho-positonium (o-Ps). Le para-positronium (indiqué en bleu sur la figure 1B) se désintègre principalement en deux photons (flèches bleues) et l'ortho-positronium se désintègre dans le vide principalement en trois photons (flèches rouges). Cependant, dans les vides intramoléculaires, l'ortho-positronium subit des processus tels que le pick-off (le positron de l'o-Ps s'annihile en deux photons (flèches vertes) avec un électron de la molécule environnante) et la conversion en para-positronium via l'interaction avec les molécules comme les molécules d'oxygène. Le para-positronium résultant se désintègre en deux photons (flèches brunes). La plage de variation de la durée de vie moyenne des o-Ps est significative et passe de 142 ns dans le vide à 1,8 ns dans l'eau15,16. Par conséquent, la durée de vie de l'ortho-positronium dépend fortement de l'environnement moléculaire : la structure nanomoléculaire et la concentration des molécules bioactives13,14,15,16,17,18,19. Les propriétés du positronium dans les échantillons biologiques ont été peu étudiées jusqu'à présent. Ce n'est que récemment que les premières études sur le positronium dans des structures cellulaires 3D ont été réalisées en cultivant des cellules sur des échafaudages de collagène20. D'autres études sur les cellules cancéreuses de la peau (carcinomes basocellulaires et épidermoïdes) ont été réalisées à l'aide d'un faisceau de positons de faible énergie limitant la pénétration cutanée21,22,23.

Les premières recherches in vitro sur la durée de vie du positronium dans les tissus de patients ont donné des résultats prometteurs en vue de l'application du positronium comme biomarqueur pour le diagnostic du cancer de l'utérus et du myxome et comme biomarqueur de l'hypoxie24,25,26,27. Récemment, le positronium a été proposé comme nouveau biomarqueur pour l'évaluation in vivo de la pathologie tissulaire13,25 qui peut être imagé à l'aide d'une méthode d'imagerie au positronium nouvellement développée15,19,26,28 lors de l'application de radionucléides à photons rapides28,29,30,31 et à haute TEP de sensibilité28. De plus, l'avènement de systèmes TEP corps entier caractérisés par une sensibilité élevée32,33,34,35 permettra l'application simultanée de l'imagerie au positronium à l'imagerie métabolique standard pendant la tomographie par émission de positrons29,36,37.

Le but de cette étude était de déterminer si l'imagerie au positronium serait sensible à la discrimination in vitro de structures tridimensionnelles ressemblant à des tumeurs (sphéroïdes) construites à partir de lignées cellulaires de mélanome avec différentes activités cancéreuses et propriétés biologiques.

Deux lignées cellulaires de mélanome, WM266-4, une lignée cellulaire de cancer du mélanome malin humain, et WM115, une lignée cellulaire d'un mélanome primaire, ont été achetées auprès de la banque de cellules de mélanome ESTDAB (Tübingen, Allemagne) et cultivées comme nous l'avons décrit précédemment38. Un compteur de cellules automatisé Luna-II™ (Logos Biosystems, Inc.) a été utilisé pour déterminer le nombre de cellules et la viabilité avant l'ensemencement des cellules.

Les deux lignées cellulaires, WM266-4 et WM115, ont été ensemencées dans des plaques sphériques 5D (5D sp5dplate, Kugelmeiers, Suisse) pour former des sphéroïdes39. La microplaque 5D a 24 puits, 12 puits avec une surface nano-revêtue pour la formation de sphéroïdes et 12 puits comme contrôle. Dans notre étude, les puits témoins n'ont pas été utilisés. Chaque puits contient 750 microcavités (avec 509 µm de diamètre et 320 µm de profondeur) qui sont séparées les unes des autres par des bordures nettes, et ces bordures empêchent la migration cellulaire d'une microcavité à l'autre ; ainsi, 9000 sphéroïdes de formes et de diamètres uniformes peuvent être cultivés dans une seule plaque.

Pour l'ensemencement cellulaire, 0,5 ml de milieu complet a été ajouté dans chaque puits. Ensuite, un milieu supplémentaire de 0,5 ml comprenant 1 125 000 cellules/puits (1500 cellules/micropuits) a été ajouté à chaque puits de la plaque. Les cellules du tube Falcon ont été remises en suspension pour les répartir dans tout le milieu puis ajoutées aux puits.

Après l'ensemencement des cellules, les plaques ont été maintenues dans un incubateur à 37°C et 5% de CO2 avec humidité. Le milieu de culture cellulaire a été renouvelé tous les jours après la formation des sphéroïdes. Deux moments appropriés de croissance sphéroïde ont été choisis pour mesurer la durée de vie moyenne des o-Ps. La morphologie des sphéroïdes et le taux de prolifération ont également été déterminés au microscope optique (Olympus, IX-LWPO, T2, Japon) les jours 4 et 8 après l'ensemencement des cellules. L'analyse des images a été réalisée par le logiciel ImageJ.

Tout d'abord, les sphéroïdes ont été dissociés en une suspension unicellulaire avec de la trypsine/EDTA (Gibco, cat. No. 25200072, Waltham, MA USA). Ensuite, 100 µl de sphéroïdes trypsine/EDTA ont été incubés pendant 10 à 20 min à 37 °C et pipetés plusieurs fois pour séparer les cellules. Ensuite, les cellules ont été centrifugées à 300 g pendant 3 min, le surnageant a été retiré et 100 µl de milieu (Gibco, cat. n° 10010056, Waltham, MA, USA) ont été ajoutés aux cellules et pipetés plusieurs fois pour séparer les cellules. complètement. Dans l'étape finale, 10 ul de cellules ont été ajoutés à 10 ul de bleu trypan et comptés (le compteur de cellules Luna-II™, Logos Biosystems, Aligned Genetics, Inc). Le flux de travail est illustré à la Fig. 2. Chaque test de viabilité a été effectué sur 4 échantillons différents dans chaque mesure dans les mêmes conditions.

Flux de travail pour l'étude de la viabilité des sphéroïdes après la récolte de sphéroïdes 3D à partir de microplaques 5D.

Après 15 min dans l'incubateur, les cellules ont été vérifiées pour s'assurer qu'il n'y avait pas d'agrégats. Après le test de viabilité à l'aide du compteur de cellules, la carte des grappes de cellules a été évaluée pour déterminer le pourcentage de grappes. Dans nos expériences, les cartes de cluster ont montré un pourcentage élevé de dissociation, supérieur à 90 %. Ensuite, la taille des cellules pour les deux lignées cellulaires en forme 3D a été vérifiée par un compteur de cellules et des investigations microscopiques. Pour estimer la taille de la cellule,

Un compteur de cellules Luna II™ a été utilisé. En ce qui concerne l'histogramme de distribution de taille, le diamètre moyen des cellules a été estimé. A titre de comparaison, la taille des cellules dans les cultures 2D a également été déterminée. A cet effet, les sphéroïdes ont été retirés de chaque puits à l'aide d'une pipette de 3 ml avec un gros alésage pour éviter de détruire la structure sphéroïde. Ensuite, les sphéroïdes ont été versés sur un tube Falcon de 15 ml et centrifugés à 500 g pendant 7 min. Dans l'étape suivante, le surnageant a été retiré et 1 ml de milieu frais a été ajouté aux sphéroïdes.

Pour évaluer l'absorption de glucose, une sonde de d-glucose émettant de la fluorescence 2-NBDG (2-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-2-désoxyglucose) (Thermo Fisher Scientific, n° de catalogue N13195) a été utilisé. Pour évaluer la distribution du taux d'absorption d'oxygène dans les sphéroïdes, les cellules WM266-4 et WM115 ont été ensemencées à des densités de 1000 et 2000 cellules/goutte. Aux jours 4 et 8, les sphéroïdes ont été transférés dans des boîtes à fond de verre et 20 μl de 2-NBDG (200 μM) ont été ajoutés à chaque sphéroïde. Les sphéroïdes ont été incubés à 37 ° C pendant 45 min. Enfin, les sphéroïdes ont été lavés avec du PBS et des images de sphéroïdes ont été prises avec un microscope Nikon Eclipse Ti-E couplé à un système confocal à balayage A1 (Nikon, Japon) à une longueur d'onde fluorescente de 494 nm/551 nm.

La distribution du taux d'absorption d'oxygène a été déterminée à l'aide d'un kit d'hypoxie, Image-IT™ Green Hypoxia Reagent (Thermo Fisher Scientific, cat. no I14834). Pour évaluer la distribution du taux d'absorption d'oxygène dans les sphéroïdes, les cellules WM266-4 et WM115 ont été ensemencées à des densités de 1000 et 2000 cellules/goutte. Aux jours 4 et 8, les sphéroïdes ont été transférés dans des boîtes à fond de verre et 20 μl de réactif d'hypoxie Image-IT ™ (10 μM) ont été ajoutés à chaque sphéroïde. Les sphéroïdes ont été incubés à 37 ° C pendant 1 h. Le colorant d'hypoxie a été échangé avec du milieu de croissance frais et les sphéroïdes ont été placés à nouveau dans un incubateur de culture cellulaire pendant les 4 h suivantes. Les images sphéroïdes ont été prises avec un microscope Nikon Eclipse Ti-E couplé à un système confocal à balayage A1 (Nikon, Japon) à une longueur d'onde fluorescente de 488 nm/520 nm.

Pour obtenir des résultats fiables et précis de la durée de vie du positronium dans les sphéroïdes, nous avons utilisé des sphéroïdes sans aucun milieu, surnageant ou composés chimiques. Dans cette méthode, les sphéroïdes récoltés à partir des microplaques ont été préparés pour la mesure de la durée de vie du positronium après centrifugation et élimination complète du milieu des sphéroïdes.

La durée de vie du positronium a été mesurée à l'aide d'un spectromètre composé de deux scintillateurs en plastique BaF2 disposés verticalement (SCIONIX, Pays-Bas) et de deux photomultiplicateurs portant les numéros de série SBO696 et SBO697 (Hamamatsu, Japon) alimentés par une alimentation haute tension (CAEN SY4527). Les signaux des photomultiplicateurs ont été lus et analysés par l'oscilloscope analyseur de données 6000A (Le Croy). Les sphéroïdes ont été irradiés par des positrons émis par le radionucléide 22Na (d'une activité d'environ 1 MBq) placé dans une feuille de Kapton. Une chambre en aluminium dédiée a été utilisée comme conteneur pour les sphéroïdes, et un support a été connecté à un appareil de chauffage pour maintenir les cellules à 37 ° C. La configuration de mesure est représentée graphiquement sur la Fig. 3.

Les sphéroïdes entourant la source de 22Na sont situés dans la chambre dédiée entre deux détecteurs de BaF2. Les sphéroïdes sont adjacents à la source de 22Na et il n'y a ni espace ni bulle entre eux. Pour chaque mesure, 106 événements avec l'enregistrement coïncident de photons de 511 keV et de photons de 1274 keV ont été collectés.

Le radionucléide 22Na après émission du positon se transforme à l'état excité de l'isotope 22Ne qui se désexcite (en moyenne après 2,6 ps) via l'émission du quantum gamma de 1274 keV29,30. Le positron perd de l'énergie en traversant les cellules et finit par s'annihiler avec l'électron en deux quanta gamma de 511 keV dos à dos. L'annihilation positron-électron peut se faire directement ou via la création du positronium. Le temps entre l'émission du positon et son annihilation est mesuré par l'enregistrement du photon de désexcitation de 1274 keV et d'un des photons d'annihilation de 511 keV. L'échantillon avec la source est positionné de manière (voir Fig. 3) qui permet l'enregistrement coïncident du gamma de 1274 keV et d'un photon de 511 keV, et empêche l'enregistrement coïncident des deux photons de 511 keV volant dos à dos. Un exemple de spectre de durée de vie déterminé à la suite de la mesure est illustré à la Fig. 4.

Exemple de spectre de durée de vie du positronium. Données expérimentales (histogramme noir) avec histogrammes superposés résultant de l'ajustement de la somme de la fonction exponentielle convoluée avec la résolution du détecteur, réalisée au moyen du programme PALS Avalanche25,40. La première composante (ligne jaune) montre la contribution de p-Ps (durée de vie moyenne : 0,125 ns), la deuxième composante (ligne verte) provient des annihilations dans la source (feuille de Kapton) (0,374 ns), la troisième composante (bleu clair ) montre la durée de vie d'annihilation libre (0,395 ns), et la quatrième composante (bleu foncé) illustre la contribution de o-Ps. La somme de toutes les contributions résultant de l'ajustement est représentée par une courbe rouge.

Avant chaque mesure, le système a été calibré à l'aide d'une chambre vide comprenant uniquement la source de 22Na. Pour effectuer la mesure, les sphéroïdes ont été transférés du tube de centrifugation à la chambre à l'aide d'un scalpeur, et des sources radioactives de 22Na ont été placées entre les échantillons. Ensuite, l'échantillon de sphéroïde a été placé à côté de la source, sans air entre la source et les sphéroïdes. Ensuite, la chambre a été placée à l'intérieur d'un support qui a été connecté à un appareil de chauffage pour maintenir les cellules à 37 ° C. Enfin, le support était situé entre deux détecteurs BaF2, comme indiqué sur la Fig. 3.

La durée de vie du positronium dans les sphéroïdes à deux moments différents, les 4e et 8e jours après l'ensemencement des cellules, a été évaluée sur la base des 106 événements collectés pour chaque cas étudié. Dans cette étude, seuls les sphéroïdes sans milieu, eau et produits chimiques ont été évalués.

La durée de vie du positronium a été extraite de chaque spectre enregistré en ajustant la somme de quatre fonctions exponentielles convoluées avec la fonction de résolution du détecteur40,41. L'exemple de spectre avec le résultat de l'ajustement est illustré à la Fig. 4. Les composants ajustés correspondent à la désintégration du para-positronium (courbe jaune), à l'annihilation directe dans la feuille source/kapton (courbe verte) et à l'annihilation de l'ortho- positronium (bleu foncé). L'expérience complète a été répétée trois fois.

Les exemples de sphéroïdes cultivés dans la microplaque sont illustrés à la Fig. 5. La lignée cellulaire WM266-4 a formé des sphéroïdes plus sphériques et concentrés que la lignée cellulaire WM115, comme indiqué précédemment38. Les sphéroïdes des deux lignées cellulaires ont montré une augmentation de leur taille et de leur circularité au fil du temps. Généralement, le taux de croissance et la taille des sphéroïdes dépendent de la taille des cavités et du type de plaques qui ont été ensemencées. Plus les microcavités sont grandes, plus les sphéroïdes formés⁠ sont gros. Bien que la taille des sphéroïdes puisse être contrôlée par l'ensemencement initial de la culture, les échelles des micropuits peuvent également affecter le diamètre du sphéroïde42.

Comparaison des sphéroïdes de différentes lignées cellulaires de mélanome. (A) Images microscopiques de deux lignées cellulaires différentes, WM266-4 et WM115, aux jours 4 et 8 de la culture. La densité et la circularité des sphéroïdes ont augmenté pendant le temps de culture. (B) En fonction du temps de culture, les sphéroïdes WM266-4 ont montré un volume plus élevé que les sphéroïdes WM115. (C) Le nombre de cellules dans la plaque a été augmenté pendant le temps de culture pour les deux lignées cellulaires. Le nombre de cellules dans une plaque a été calculé à l'aide du compteur de cellules Luna II après la récolte des sphéroïdes.

La figure 5B,C montre que les sphéroïdes WM266-4 et WM115 ont augmenté au fil du temps. Les sphéroïdes WM266-4 ont montré un taux de prolifération plus rapide que les sphéroïdes WM115, qui sont revenus à leurs caractéristiques malignes.

La figure 5B montre qu'il y a eu une augmentation du nombre de cellules depuis l'ensemencement cellulaire jusqu'au 8ème jour après la culture. Le taux de division des cellules WM266-4 dans les sphéroïdes était supérieur à celui des cellules WM115. WM266-4 a entraîné des augmentations de 1,5 et 2,74 fois du nombre de cellules après 4 et 8 jours, respectivement. Le nombre de cellules dans les sphéroïdes WM115 a augmenté de 1,4 et 1,7 fois après 4 et 8 jours, respectivement. Un total de 36 000 sphéroïdes ont été utilisés dans chaque mesure de la durée de vie du positronium.

Les sphéroïdes WM266-4 comprenaient des cellules d'un diamètre de 15,70 ± 0,10 μm au jour 4 après l'ensemencement des cellules et de 15,92 ± 0,08 μm au jour 8, tandis que le diamètre des cellules sphéroïdes WM155 était égal à 16,66 ± 0,20 μm au jour 4 et 17,28 ± 0,25 μm au jour 8. La taille moyenne des cellules colorées en culture cellulaire 2D était inférieure à la taille des cellules des sphéroïdes 3D, 14,65 ± 0,09 μm et 16,27 ± 0,10 μm pour WM266-4 et WM115, respectivement.

Le nombre de cellules dans les deux lignées cellulaires a augmenté avec le temps. La croissance observée était plus rapide pour la lignée cellulaire WM266-4 que pour la lignée cellulaire WM115. WM115 a un temps de doublement plus long que WM266-4, environ 7,5 et 6 jours, respectivement, ce qui signifie que les cellules de la lignée WM115 passent plus de temps dans leur cycle cellulaire que les cellules de la lignée WM266-4. Le temps de doublement (DT) des sphéroïdes est généralement caractérisé comme le temps de doublement réel de la tumeur et est calculé en utilisant le volume de sphéroïde via :

où V1 et V2 sont des volumes sphéroïdaux aux instants t1 et t2 = t1 + t après l'ensemencement, respectivement43,44,45.

Selon l'analyse de l'intensité de fluorescence (Fig. 6), la région entre 100 et 200 µm du centre d'un sphéroïde était considérée comme la couche externe, également appelée bord de prolifération, et la région entre 50 et 100 µm de la partie interne de le sphéroïde était considéré comme un noyau nécrotique. Cependant, la taille des différentes couches d'un sphéroïde dépend de la taille du sphéroïde. L'intensité de fluorescence après 4 jours dans les sphéroïdes obtenus à partir d'un nombre initial de 1000 cellules au bord des sphéroïdes WM266-4 n'était pas significativement plus élevée que celle de WM115 (p = 0,20), tandis que dans la région plus profonde des sphéroïdes, une intensité plus élevée de l'absorption de glucose a été observée dans les sphéroïdes WM266-4 que dans les sphéroïdes WM115 (p = 0,00001). Les sphéroïdes plus grands formés à partir de 2000 cellules ont montré une absorption de glucose plus élevée après 4 jours, et l'intensité était significativement plus élevée dans le bord de la prolifération (p = 0,04) et dans la zone centrale des sphéroïdes WM266-4 par rapport aux sphéroïdes WM115 (p = 0,0018). Au jour 8, les sphéroïdes WM266-4 et WM115 ont montré une différence significative dans l'intensité de l'absorption de glucose dans le bord de prolifération (p = 0, 007) mais pas dans le noyau (p = 0, 064) (Fig. 6).

Détermination de la distribution du glucose dans les sphéroïdes de mélanome. On observe une concentration de glucose également répartie dans le bord de prolifération des sphéroïdes WM266-4 (A) et des lignées cellulaires WM115 plus dispersées (B) avec des différences significatives dans les sphéroïdes plus grands et plus anciens. Parcelle de distribution du glucose dans les sphéroïdes WM266-4 (C) et WM115 (D) à deux moments de culture différents, évalués avec la sonde 2-NBDG.

Au jour 4 de la culture, la progression de l'hypoxie mesurée en tant qu'intensité de fluorescence dans les sphéroïdes avec un nombre initial de cellules de 1000 n'était pas significativement différente (p> 0,05), tandis qu'au jour 8, le degré d'hypoxie au centre des sphéroïdes WM266-4 était significativement plus élevée que celle des sphéroïdes WM115 (p = 0,0001). Dans les sphéroïdes plus gros pendant la culture, le degré d'hypoxie des sphéroïdes WM266-4 était significativement plus élevé (p <0,001) que celui des sphéroïdes WM115, tandis qu'au jour 8, les sphéroïdes WM266-4 et WM115 ont montré une différence significative dans la progression de l'hypoxie en leur centre (p = 0,00048) mais pas dans la partie externe (p = 0,24) (Fig. 7).

Détermination de la progression de l'hypoxie dans les sphéroïdes de mélanome. La région hypoxique est observée au centre des sphéroïdes dans les lignées cellulaires (A) WM266-4 et (B) WM115 avec des différences significatives dans les sphéroïdes plus grands et plus anciens. Tracé de la distribution de l'hypoxie dans les sphéroïdes WM266-4 (C) et WM115 (D) à deux moments de culture différents, évalués avec la sonde Image-IT™ Green Hypoxia.

La durée de vie moyenne des atomes d'ortho-positronium dans les sphéroïdes a été établie pour deux lignées cellulaires différentes caractérisées par différents degrés de malignité : WM115 et WM266-4. Les deux mesures ont été effectuées pour les sphéroïdes à deux moments différents : les jours 4 et 8 après l'ensemencement. Les tests de viabilité ont été évalués avant et après chaque mesure PALS et ont montré que la viabilité des sphéroïdes restait constante au-dessus de 85 % jusqu'au 8e jour. Ainsi, les sphéroïdes étaient en bon état stable au cours de l'expérience.

La mesure de la durée de vie du positronium a été répétée trois fois. Dans chaque mesure, des sphéroïdes ont été récoltés à partir de la plaque et placés à l'intérieur de la chambre.

La figure 8 montre les résultats de la durée de vie et de la distribution moyennes des o-Ps dans les sphéroïdes de mélanome 3D avec différents niveaux de malignité à deux âges différents.

Comparaison de la durée de vie et de l'intensité moyennes de l'o-Ps pour différentes lignées cellulaires de mélanome. (À gauche) La durée de vie des o-Ps dans les sphéroïdes WM266-4 (carrés noirs) et WM115 (points rouges) à deux âges différents, 4 et 8 jours après l'ensemencement des cellules. (À droite) Intensité de la production de o-Ps dans les sphéroïdes WM266-4 (carrés noirs) et les sphéroïdes WM115 (points rouges) en fonction du temps. Pour comparer les o-Ps moyens par rapport au métabolisme des sphéroïdes, veuillez consulter le fichier complémentaire 1.

Les résultats obtenus donnés dans le tableau 1 montrent que les sphéroïdes WM266-4 avec plus de malignité, de taux de prolifération et de concentration élevée de cellules dans les sphéroïdes ont une durée de vie moyenne ortho-positonium plus courte que les cellules WM115, par conséquent, des vides intermoléculaires libres plus petits que les cellules WM115 de la tumeur primaire avec moins de taux de division et une concentration plus faible de cellules au fil du temps. Bien que les deux lignées cellulaires montrent une diminution progressive de la durée de vie des o-P pendant la durée de la culture, les o-P montrent une durée de vie plus longue dans WM115 que dans les sphéroïdes WM266-4. L'intensité dans les sphéroïdes WM266-4 est restée presque constante tandis que les sphéroïdes WM115 présentent une diminution de l'intensité de <3SD>, qui peut être considérée comme des changements au niveau moléculaire dans les cellules des sphéroïdes WM115.

Récemment, l'imagerie du positronium a été introduite14,15,19,46, et les premières images de positronium in vitro ont été démontrées25,26, ouvrant de nouvelles possibilités pour l'amélioration du diagnostic du cancer en utilisant le positronium comme biomarqueur de la pathologie tissulaire13,14.

L'objectif principal de cette étude était de tester l'hypothèse selon laquelle le positronium pourrait servir de nouveau biomarqueur pour évaluer les différentes activités cancéreuses et propriétés biologiques dans les cellules cancéreuses et de réaliser les premières études des propriétés du positronium dans des sphéroïdes cellulaires 3D. Pour tester cette hypothèse, des sphéroïdes 3D ont été utilisés car ils peuvent imiter la structure de tumeurs réelles dans des conditions physiologiques. La morphologie et les interactions cellule-cellule dans les sphéroïdes 3D sont complètement différentes de celles de la culture cellulaire monocouche. De plus, ils présentent certains avantages par rapport aux méthodes de recherche standard, notamment un faible coût d'utilisation, une reproductibilité élevée, un gain de temps et un besoin réduit de modèles animaux de laboratoire. Les propriétés uniques des sphéroïdes tumoraux 3D les rendent inestimables pour les expériences biologiques et les tests de médicaments dans une variété d'études expérimentales axées sur la chimiothérapie et la radiothérapie1,2,3,4,5,47,48.

Le temps de cycle cellulaire dans les cellules 2D et les sphéroïdes 3D est significativement différent car les cellules en culture cellulaire monocouche ont des conditions biologiques homogènes ; dans une monocouche confluente, la plupart des cellules sont dans le même cycle cellulaire et ont une accessibilité suffisante aux nutriments et à l'oxygène. Dans la culture cellulaire 3D avec une structure multicouche, les cellules sont dans des cycles cellulaires différents, et l'accessibilité aux nutriments nécessaires à la survie dépend de leur distance à la surface49. Au cours du cycle cellulaire, les cellules de la phase G1 se développent jusqu'à la fin de la phase G2 lorsque la mitose et la division commencent après avoir passé les points de contrôle. Dans les sphéroïdes, l'espace de prolifération est limité et un noyau nécrotique est formé entouré d'une couche au repos où les cellules sont arrêtées dans la phase G1 du cycle et d'un rebord proliférant à la partie la plus externe des sphéroïdes où les cellules peuvent rester dans le S /G2/M phase50. Une différence significative dans la dynamique de la formation de sphéroïdes et de la prolifération cellulaire a été observée dans notre étude. Nous avons observé que la lignée cellulaire la plus maligne (WM266-4) formait des sphéroïdes plus gros (à la fois aux jours 4 et 8 de culture) avec un nombre plus élevé de cellules (Fig. 5B, C), et le diamètre cellulaire dans les sphéroïdes était inférieur à que dans la lignée cellulaire de mélanome primaire (WM115).

Les recherches antérieures sur la durée de vie du positronium ont été principalement effectuées sur différents types de tissus et de cultures de cellules monocouches, telles que le cancer de la peau et les cellules cancéreuses colorectales20,21,22,23,46,51,52. Dans cette nouvelle recherche, la durée de vie du positronium a été évaluée dans des sphéroïdes 3D plutôt que dans une culture cellulaire ou un tissu 2D. Bien que de nombreuses recherches aient été effectuées sur le positronium dans les matériaux et les échantillons biologiques, la recherche utilisant des agrégats de cellules 3D se limite à la détermination de la durée de vie de l'o-Ps dans des agrégats de cellules de cancer colorectal 3D avec un mélange de cellules et de collagène20. La durée de vie moyenne des o-Ps s'est avérée être un indicateur sensible du volume moyen des vides dans les cultures cancéreuses 3D stimulées avec le facteur de croissance affectant la stimulation des cellules épithéliales (TGF-β). Les colonies traitées avec le TGF-β ont montré une croissance avec l'o-Ps moyen 2 à 3 semaines après la stimulation, qui a diminué jusqu'à la valeur dans les conditions de contrôle dans la phase tardive de la culture19. Cette distribution o-Ps a indiqué une relation possible entre la dynamique cellulaire et les vides moléculaires moyens. Le comportement de diffusion de petites molécules (Å) a été étudié à l'aide de PALS dans différents échantillons biologiques (cheveux, plumes, coton et soie), montrant que les o-P sont sensibles à l'investigation des vides dans les polymères biologiques53,54. Les durées de vie des o-Ps dans la cellule peuvent être différentes de la durée de vie mesurée dans le cas où la cellule se trouve dans le milieu contenant de l'eau, du collagène ou d'autres composés chimiques, car la surface cellulaire, la croissance cellulaire et la forme des cellules peuvent être modifié.

Dans notre étude, nous nous sommes concentrés sur le stade précoce de la prolifération spontanée de deux lignées cellulaires cancéreuses différentes. Ces lignées cellulaires diffèrent par la taille des cellules, les cellules WM155 étant plus grandes que les cellules WM266-4. Ainsi, lors de la formation de sphéroïdes, les cellules WM266-4 compensent leur plus petite taille avec un taux de prolifération plus élevé pour former des sphéroïdes plus gros. Leur temps de doublement était plus court que celui des cellules WM115 et les cellules WM266-4 ont passé moins de temps dans leur cycle cellulaire que les cellules WM115. Ces différences importantes dans la dynamique cellulaire au stade précoce de la croissance des sphéroïdes ont été indiquées par la durée de vie plus courte de l'o-Ps pour les sphéroïdes WM266-4 au jour 4 de la culture. Dans notre étude précédente, nous avons comparé le pourcentage de cellules viables tel qu'évalué par le test de fluorescence FDA/PI (acétate de fluorescéine et iodure de propidium) in situ, et nous n'avons observé aucune différence entre la viabilité cellulaire dans la phase précoce de la formation de sphéroïdes (sur jour 4) pour ces deux lignées cellulaires de mélanome, mais un noyau nécrotique plus important a été reconnu dans les sphéroïdes WM115 par rapport à WM266-4 (29,36 contre 13,66 % de cellules mortes)38. Ces résultats sont en concordance avec les tests de distribution du glucose et de l'hypoxie, où le noyau du sphéroïde a été reconnu comme la région avec la concentration de glucose la plus faible et les conditions hypoxiques les plus élevées. Une diminution de la concentration de glucose (probablement causée par une diffusion réduite ou une augmentation du métabolisme anaérobie - glycolyse) a été observée chez les sphéroïdes plus âgés (jour 8 en culture) et ceux formés à partir de plus de cellules (Fig. 6). Fait intéressant, la forme irrégulière de WM115 a permis à la sonde fluorescente de pénétrer plus profondément dans le noyau, ce qui a été observé comme un pic d'intensité de fluorescence dans la région comprise entre 50 et 75 µm du centre du sphéroïde (Fig. 6D). Cette disponibilité du glucose peut faciliter le métabolisme anaérobie du glucose (glycolyse) dans la lignée cellulaire WM115 et peut être liée à la durée de vie moyenne plus élevée des o-Ps dans ces conditions.

Nous avons également effectué des mesures supplémentaires pour comparer la durée de vie de l'o-Ps dans des cultures cellulaires 2D et 3D. Les résultats obtenus (Fig. 9) démontrent que la durée de vie du positronium est plus petite en culture cellulaire 3D qu'en culture cellulaire 2D55. Ce graphique montre comment la durée de vie moyenne des o-Ps est différente entre les cultures cellulaires 2 et 3D, ce qui est dû à leur diversité dans les propriétés biologiques et le métabolisme. Les lignées cellulaires WM155 et WM266-4 étaient caractérisées par une expression génique différente, par exemple celles responsables du transport des acides aminés et de nombreux autres liés à la formation des jonctions cellulaires, à la migration et à la mobilité12,56.

Comparaison de la durée de vie moyenne du positronium dans la culture cellulaire 2D et 3D du mélanome. La durée de vie des o-Ps dans la culture cellulaire WM266-4 2D (carré noir) selon Ref.55, la durée de vie des o-Ps dans la culture cellulaire WM266-4 2D (triangle noir) et la durée de vie des o-Ps dans WM266 -4 La culture cellulaire 3D (points noirs) montre la durée de vie de l'o-Ps dans des sphéroïdes de deux âges différents, 4 et 8 jours après l'ensemencement cellulaire.

Cette étude a été menée pour évaluer la distribution à vie de l'ortho-positronium dans les sphéroïdes de cellules de mélanome WM266-4 et WM115 caractérisés par différents degrés de malignité. Les mesures ont été effectuées à deux moments différents (4 et 8 jours) après l'ensemencement. Pendant ce temps, les deux lignées cellulaires sphéroïdes ont montré une réduction de la durée de vie de l'o-Ps, ce qui revient à la prolifération cellulaire progressive dans les sphéroïdes. Les sphéroïdes WM266-4 plus malins ont montré une durée de vie o-Ps plus courte que les sphéroïdes de la lignée cellulaire WM115.

En résumé, les résultats montrent que la durée de vie des o-Ps est un paramètre utile pour différencier les cellules cancéreuses ayant des caractéristiques biologiques différentes. Plus le degré de malignité et le taux de prolifération des cellules néoplasiques sont élevés, plus la durée de vie de l'ortho-positronium est courte. Cette recherche ouvre la voie au développement de biomarqueurs de positronium à l'aide d'un modèle de sphéroïde cellulaire.

Les ensembles de données générés et analysés au cours de l'étude actuelle contenant des données numériques, des modèles mathématiques et des résultats de calcul, y compris des graphiques d'ajustement, sont disponibles dans le référentiel de l'Université Jagiellonian (RUJ) sur le lien https://ruj.uj.edu.pl/xmlui /handle/item/29740557.

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Ce travail a été soutenu par la Fondation pour la science polonaise (FNP) à travers le programme TEAM POIR.04.04.00-00-4204/17, par le Centre national des sciences de Pologne à travers les subventions no. 2019/33/B/NZ3/01004, 2021/42/A/ST2/00423 et 2021/43/B/ST2/02150, l'Université Jagellonne via les projets CRP/0641.221.2020, SciMat et le budget des domaines de recherche prioritaires qLife dans le cadre du programme Excellence Initiative—Research University, et la subvention DSC no. N17/MNS/000023 Mme Hanieh Karimi, pour sa thèse de doctorat.

Département de physique médicale, Institut de physique M. Smoluchowski, Faculté de physique, d'astronomie et d'informatique appliquée, Université Jagellonne, Łojasiewicza 11 Street, 30-348, Cracovie, Pologne

Hanieh Karimi & Ewa L. Stępień

Département de biochimie, Université du Missouri, Columbia, États-Unis

Hanieh Karimi

Département de physique expérimentale des particules et applications, Institut de physique M. Smoluchowski, Faculté de physique, d'astronomie et d'informatique appliquée, Université Jagellonne, Cracovie, Pologne

Paul Moscal

Centre de Théranostique, Université Jagellonne, Cracovie, Pologne

Paweł Moskal & Ewa L. Stepien

Faculté de chimie, Université Jagellonne, Cracovie, Pologne

Agathe Zak

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HK : Méthodologie, enquête, rédaction—ébauche originale, visualisation, révision et édition, PM : Conceptualisation, méthodologie, logiciel, analyse formelle, ressources, conservation des données, rédaction—ébauche originale, révision et édition, visualisation, supervision, administration de projet, financement acquisition,A.Ż. : Méthodologie, enquête, E.Ł.S. : Conceptualisation, méthodologie, enquête, ressources, conservation des données, rédaction - révision et édition, supervision, acquisition de financement.

Correspondance avec Ewa L. Stępień.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Karimi, H., Moskal, P., Żak, A. et al. Modèle sphéroïde de mélanome 3D pour le développement de biomarqueurs de positronium. Sci Rep 13, 7648 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34571-4

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Reçu : 19 juin 2022

Accepté : 03 mai 2023

Publié: 11 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-34571-4

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